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小編今天就來扒一扒生物實(shí)驗(yàn)室污染之PCR實(shí)驗(yàn)污染你不知道的事。
在眾多的生物實(shí)驗(yàn)室,分子生物學(xué)檢測方法如PCR因其高靈敏度、快速、操作方便等優(yōu)勢(shì)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用,不過正是由于它靈敏度高,微量的污染源都有可能導(dǎo)致檢測結(jié)果的假陽性,所以對(duì)環(huán)境污染的控制也極為嚴(yán)格。面對(duì)眾多的污染源,比如樣本交叉污染、試劑儀器交叉污染、克隆質(zhì)粒污染、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染、還有容易忽視的氣溶膠污染。氣溶膠是由固體或液體小質(zhì)點(diǎn)分散并懸浮在氣體介質(zhì)中形成的膠體分散體系,在空氣與液體面摩擦?xí)r,比如在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管,開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆??珊?/span>48000拷貝,因而由其造成的污染是一個(gè)非常重要而被忽視的污染源。
雖然這些污染對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響已經(jīng)受到了廣泛重視,多數(shù)實(shí)驗(yàn)室對(duì)污染控制都采取了各種辦法,比如定期大掃除清理、劃分操作區(qū)域、試劑分裝、操作謹(jǐn)慎、重復(fù)實(shí)驗(yàn)、多角度驗(yàn)證結(jié)果。但是微量的核酸片段就能被擴(kuò)增,所以對(duì)污染物的控制不僅僅是做到這些就能夠杜絕和避免的,關(guān)鍵是需要從源頭控制。目前多數(shù)生物試驗(yàn)室,分子實(shí)驗(yàn)每天都在大規(guī)模進(jìn)行,污染源已經(jīng)無處不在,特異性的,非特異性的,同源的,非同源的,廣泛分布在樣本容器、實(shí)驗(yàn)室臺(tái)面,試劑溶液中、儀器表面內(nèi)管附著等等,你以為普通的清理就能解決這些污染源嗎?必須是不行的,實(shí)驗(yàn)室大拿們都為了清除這些污染源研究出好多種方法,整理跟大家共享。
傳統(tǒng)方式 |
原理 |
優(yōu)勢(shì) |
不足 |
酒精擦拭 |
將核酸沉淀,擦拭后保證污染表面污染得到一定程度緩解 |
簡單、方便、成本低 |
不徹底(核酸片段本身沒有變化,仍然存在導(dǎo)致氣溶膠污染的可能性)、細(xì)小孔徑器材無法清除 |
修飾 |
標(biāo)記遺傳物質(zhì),阻止聚合酶與核酸的結(jié)合,從而抑制DNA擴(kuò)增 |
效果相對(duì)好 |
反應(yīng)可逆、成本高、試劑可能具有不安全影響 |
酶解 |
酶可將長鏈的核酸分子降解成小片段 |
速度快,效果相對(duì)較好 |
降解的核酸中仍有大片段存在,具有完整的遺傳信息,可通過PCR擴(kuò)增出完整的片段、成本高 |
高壓變性 |
高壓可將核酸降解成20~30bp的小片段 |
徹底,成本低 |
僅適用于耐高壓材料,更無法應(yīng)用實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)和大型的實(shí)驗(yàn)設(shè)備 |
紫外照射 |
PCR產(chǎn)物中嘧啶堿基會(huì)形成二聚體,延伸終止 |
方便,范圍廣,成本低 |
僅對(duì)500bp以上長片段有效,對(duì)短片段效果不大,且并不是DNA鏈中所有嘧啶均能形成二聚體,且UV照射還可使二聚體斷裂 |
縱然有這么多解決核酸污染源的辦法,但是大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室卻由于使用不方便、操作復(fù)雜、成本高、危害大而沒有持續(xù)采用,實(shí)驗(yàn)室累積的污染也就越來越多,有些實(shí)驗(yàn)者甚至在ddH2O中擴(kuò)增出了條帶,結(jié)果可重復(fù)性差、投稿文章被質(zhì)疑,不得不重新實(shí)驗(yàn),當(dāng)然在實(shí)驗(yàn)之前,必須要徹底清除這些污染源,這么嚴(yán)重的污染如何高效的清除,是一個(gè)迫在眉睫的問題。目前國外學(xué)者經(jīng)過不斷研發(fā)拓展,有一款清除劑DNA-ExitusPlus已經(jīng)問世,并得到了Nature Methods的推薦,此款清除劑純綠色配方,能夠?qū)⑽廴驹吹暮怂崞螐氐捉到獬珊塑账釣閱挝坏臉O小片段,此過程不可逆,避免了污染重復(fù)的可能性,使用方便,使用與所有臺(tái)面,儀器擦拭,小部件浸泡等,無污染,無腐蝕性,對(duì)人體無危害。簡直是廣大核酸污染受害者的福音啊。
小編當(dāng)初在實(shí)驗(yàn)室就遇到了PCR污染,可苦于當(dāng)時(shí)不知道世上竟有如此神器,實(shí)驗(yàn)反反復(fù)復(fù)折騰了好多次才得到圓滿結(jié)果,好東西就要分享,在此推薦給大家,希望對(duì)各位看官有所幫助。
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